藩内改革派と保守派が藩政の主導権を争っていた長州藩では、1863年（文久3年）5月、馬関海峡を航行中の外国船を自藩製の大砲で攻撃して「攘夷」を決行した。また、京都における主導権争いから薩摩藩らと衝突、1863年（文久3年）8月、三条実美らの七卿落ち、翌1864年（元治元年）の池田屋事件を契機に薩摩藩・会津藩・桑名藩と武力衝突した（禁門の変）。
禁門の変を理由に幕府は、第一次長州征伐を決行、同時期に、英米仏蘭4ヶ国艦隊の反撃に遭い、上陸され砲台を占拠された（四国艦隊下関砲撃事件）。その後、高杉晋作、木戸孝允らが藩政を掌握した。
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このような情勢下、薩摩、長州ら政争を繰り返していた西国雄藩は坂本龍馬、中岡慎太郎の周旋により、同盟を締結（薩長同盟）した。その後、幕府は第二次長州征伐を決行するが、高杉晋作の組織した奇兵隊などの庶民軍の活躍に阻まれ、また、総指揮者である将軍徳川家茂が大坂城で病没するなどもあり、失敗した。
折から幕法に反して京都に藩邸を置く諸大名を制御できず、京都の治安維持さえ独力でおぼつかない幕府と、幕藩体制の根幹である「武士」の武力に対する信頼とその権威は、この敗北によって急速になくなっていった。薩長は、土佐藩、肥前藩をも巻き込み、開国以来の違勅条約に対する反対論と外国人排撃を主張、実行に移そうとする「攘夷」を、国学の進展などにより江戸時代後期から広がっていた国家元首問題としての尊王論とを結びつけ、「尊皇攘夷」を旗頭に「倒幕」の世論を形成していった。